无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗的制备及免疫效果评价

为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip-GAPDH在各个组织(包括肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏)中的表达情况。采用ELISA、Real-time PCR法和体外攻毒法分别分析各实验组不同时间血清抗体效价、免疫基因(IgM、IL-1β和CD8)表达变化规律和相对保护率,研究该嵌合性疫苗对吉富罗非鱼的保护效果。结果显示,实验组在免疫接种第7和第28天时,注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏均能检测到嵌合性质粒,实验组罗非鱼血清抗体效价均高于对照组并于21 d时达到峰值(1∶4 096);qPCR数据表明,实验组鱼体胸腺、头肾和脾脏的IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调,并且在胸腺、头肾和脾脏中的表达量分别在免疫后第12和第48 h达到峰值;免疫后42 d进行人工攻毒后计算免疫保护率为93.3%。以上研究结果表明,本研究构建的无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗在罗非鱼链球菌病防治中具有潜在的应用价值。     

Cloning and expression of a surface immunogenic protein in Streptococcus dysgalactiae isolated from fish and its application in enzyme‐linked immunosorbent assays to diagnose S. dysgalactiae infections in fish

Lancefield group C Streptococcus dysgalactiae (GCSD) causes severe necrotic lesions in the caudal peduncle in the genus Seriola farmed in Japan. To develop a sero‐diagnostic method for GCSD infection in farmed fish, we attempted to identify a surface immunogenic protein that induces an antibody after infection with GCSD by immunoblot analysis using sera collected from infected fish. A protein obtained from sodium dodecyl sulfate (SDS) extracts of GCSD was identified as S. dysgalactiae surface immunogenic protein (Sd‐Sip). Sd‐Sip exhibited more than 94% homology with a surface antigen or a hypothetical protein from S. dysgalactiae mammalian isolates at the nucleotide sequence level. Expression of the recombinant Sd‐Sip (rSd‐Sip) was confirmed by immunoblot analysis, that is, its reactivity to GCSD‐infected sera. Antibody detection ELISA using rSd‐Sip and their usefulness for diagnosis of GCSD infection were examined. GCSD‐infected sera collected from farmed amberjack, Seriola dumerili (Risso), showed strong reaction with immobilized rSd‐Sip. Meanwhile, sera immunized by other pathogenic bacteria of fish were showed ELISA values similar to those of non‐infected sera. These results of this study suggest that the antibody detection ELISA using rSd‐Sip is an effective diagnostic method for GCSD infection in fish.     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

无乳链球菌致病因子的研究进展

无乳链球菌是人和动物的主要致病菌之一,该菌可引起人和动物的脑膜炎、肺炎、败血症等疾病。目前已发现的无乳链球菌主要致病因子包括荚膜多糖、溶血素、透明质酸酶、环磷酸腺苷(CAMP)因子、超氧化物歧化酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等。作者就上述几类致病因子进行综述,介绍了近年来国内外无乳链球菌的致病性及致病机理等方面的一些研究进展。     

猪链球菌7型的分离鉴定及药敏试验

某猪群暴发类似猪链球菌病,为确诊和防制该病,通过将病料接种到血液营养琼脂培养基和TSA培养基分离细菌,对分离菌株进行生化鉴定和PCR鉴定,并接种小白鼠进行动物试验和药敏试验。结果表明,分离的细菌为猪链球菌7型,对小白鼠具有致病性,且对恩诺沙星和头孢唑啉高度敏感。该结果对临床防制猪链球菌病具有参考意义。     

罗非鱼无乳链球菌生物学特性与致病力研究

本试验分离纯化1株致使罗非鱼具有链球菌发病症状的病原菌,药敏试验结果表明,该菌对氯霉素等10种药物敏感。PCR扩增该菌的cfb基因,将扩增片段测序后与GenBank上登录的罗非鱼无乳链球菌的cfb基因序列进行比对。同时对该病原菌的生物学特性进行研究,包括培养时间和pH对该菌生长的影响;培养温度对其致病力的影响;探讨了不同攻毒方式(腹腔、胸腔和背部肌肉注射)与鱼发病快慢的关系;并对不同规格(100和10 g左右)的罗非鱼对该菌的易感性进行分析。试验结果表明,该病原菌为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae);该菌的最适培养时间为11.5 h,最适培养pH为7.5;腹腔、胸腔和背部肌肉注射后,其发病时间几乎一致,但胸腔注射的试验鱼死亡速度最慢,背部肌肉注射是较安全可行的攻毒方式;33℃培养的无乳链球菌攻毒的罗非鱼发病最快,死亡最集中;100 g的试验鱼比10 g的试验鱼更易感染。     

藏绵羊肺脏中链球菌的分离鉴定及耐药性分析

本试验通过无菌采集西藏地区绵羊肺脏,然后进行细菌分离、纯化及PCR鉴定;同时,对分离的链球菌菌株进行药物敏感性研究,以期为生产实践中对该病原的防制提供参考信息。结果显示,纯化所得到的细菌呈革兰氏阳性链球状,经PCR、克隆、测序鉴定为链球菌;药敏试验结果显示分离菌株对复方新诺明、恩诺沙星、庆大霉素及四环素等大部分药物敏感。本研究为西藏地区绵羊链球菌病的有效防制提供参考。     

重庆地区表观健康猪中猪链球菌的检测

本研究旨在调查重庆地区表观健康猪的猪链球菌带菌情况,并揭示健康猪群携带猪链球菌的公共卫生学意义。随机采集重庆市17个区县(市)定点屠宰场表观健康猪的腭扁桃体1 360份,进行猪链球菌的分离鉴定,并对致病性较强的1、2、7、9、14型及1/2型进行分型与毒力因子分析。结果共分离到225株猪链球菌,分离率为16.54%;检出猪链球菌2型4株,猪链球菌7型3株,猪链球菌9型3株,猪链球菌1/2型1株;毒力因子谱分析发现多数(10/11)分离株缺失部分毒力因子,但也存在具有全部已知毒力因子的强毒株,且在国内首次检出小片段mrp型猪链球菌1/2型1株和7型2株。结果提示,重庆地区健康猪群带菌现象普遍,且流行菌株具有与国外不同的特点,对屠宰场工作人员健康造成威胁。     

猪链球菌种及其1、2、7型多重PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立致病性猪链球菌种及其1、2、7型的快速多重PCR检测方法,并进行初步的临床应用。【方法】根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及其1(14)、2(1/2)、7型特异的cps1I、cps2H、cps7H基因序列,分别设计4对引物,通过对单个基因PCR和多重PCR扩增条件、反应体系的优化,建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的4重PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株,对建立的多重PCR方法进行特异性和敏感性试验。用所建立的4重PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品的PCR产物进行测序验证。【结果】所建立的4重PCR方法特异、敏感,对猪链球菌2型的最低检出水平为2.52×103CFU/mL。临床检测及测序结果显示,该多重PCR准确性较高。【结论】建立的4重PCR方法可用于猪链球菌主要致病血清型的快速检测。